一、引言与背景

1. 细胞转染 / 转导技术简介

在分子生物学、基因工程、细胞生物学、细胞治疗等研究领域，经常需要将外源 DNA、RNA、siRNA、蛋白质等大分子物质导入细胞内部，以实现基因表达、基因敲除/敲入、蛋白功能研究、信号通路干扰、细胞改造等目的。这一过程称为“转染”（transfection，用于真核细胞）或“转化 / 转导”（在某些上下文下）。

常见的转染方法包括化学法（如脂质体、聚合物载体、钙磷法）、病毒载体法、物理法（如微针注射、基因枪、生物电转／电穿孔等）。这些方法各有优缺点，适用于不同类型的细胞和实验目的。

物理法通常具有快速、无需载体、适应性广等特点。其中，电穿孔（Electroporation / 电转染 / 电转） 是最古老、也是最通用的一类物理转染技术，它通过施加短暂而强烈的电场脉冲，在细胞膜上产生暂时性微孔，使外源物质（如核酸、蛋白）借助电场和扩散进入细胞内部，然后细胞膜自行修复。这种方法对于很多“难以转染”的原代细胞、干细胞、免疫细胞等，往往比化学方法更具优势。

电穿孔仪（或称电转仪、电穿孔转染系统、电转染仪器等）即是用于施加电场脉冲并控制相关参数的专用设备。本篇将重点介绍电穿孔仪在细胞转染中的原理、技术细节、应用及发展。

二、电穿孔原理机制

1. 细胞膜与膜电位基础

细胞膜主要由磷脂双分子层及嵌入的膜蛋白组成。磷脂双层具有较高的电阻，限制离子和带电大分子自由通过。细胞在生理状态下，膜内外存在离子浓度梯度，形成一定的跨膜电位（通常内负外正）。这种膜电位以及膜电容特性使得在外加电场时，外部电场主要集中在膜上。

当外加电场施加于悬浮于导电介质中的细胞时，细胞膜两侧的离子在电场作用下发生极化，构建起额外的电位差（称为诱导跨膜电压）。如果外加电场足够强，则诱导跨膜电压超过某一阈值，就可能造成膜结构的短暂破坏，形成微孔。

2. 膜穿孔与孔道形成过程

在外电场作用下，膜上可能出现以下连续过程：

1. 极化积累：在电场作用下，离子和极性分子在膜两侧重新分布，使得膜两侧电荷积累，诱发跨膜电压上升。

2. 膜张力和膜应力作用：电场会对膜造成电力与热力作用，导致膜局部张力增高。

3. 孔隙起核：一旦诱导跨膜电压超过阈值（通常在几伏至数十伏上下，具体取决于细胞尺寸、膜性质、电极配置等），膜结构上可能发生局部破裂或气隙起核，微小孔隙逐渐形成。

4. 孔隙扩展与稳定化：初始的孔隙可能较小，通过电场驱动力和膜应力作用，孔径可以短暂扩展到若干十到数百纳米（甚至更大，视条件而定）。此时，带电分子（如 DNA、RNA）在电场驱动下可能被“吸引”进入孔道。

5. 孔隙关闭 / 修复：当电场关闭后，膜恢复内外风化（离子重组、脂质重排、膜蛋白辅助修复等机制），孔隙逐渐关闭，膜结构恢复完整。

根据电场强度和脉冲参数等条件，孔隙的开放程度和持续时间可以不同。若电场过强或脉冲时间过长，孔隙可能无法修复，造成不可逆损伤（即细胞死亡）。通常在转染实验中，需要在“高转染效率”和“高细胞存活率”之间取得平衡，从而操作在可逆电穿孔（reversible electroporation）区间。

3. 外源分子进入细胞的驱动力

在孔隙开放期间，外源分子（如 DNA、mRNA、siRNA、蛋白质、核酸–蛋白质复合物等）可借助以下几种机制进入细胞：

• 电泳 / 电场驱动：在电场作用下，带电分子（尤其是 DNA、RNA 等）朝着电极方向运动，可能经由开放孔隙进入细胞。

• 扩散 / 热运动：即使在电场作用下，分子也存在随机扩散成分，可能在孔隙附近随机穿过。

• 膜–孔边界效应：分子可能首先被吸附在膜表面，待孔隙形成后，从黏附位点直接进入膜内部。

• 孔隙扩散：一些较小或中等尺寸分子可能通过孔隙扩散进入。

孔隙关闭后，这些进入细胞的外源分子会被“困”在细胞内，并可能被运送至细胞核或其他亚细胞结构，从而实现表达或作用。

三、电穿孔仪器组成与类型

1. 基本组成

一个完整的电穿孔系统通常包括以下几个主要部分：

• 高压脉冲发生器 / 驱动单元：提供可调节的高压（通常从几十伏到几千伏）和可控脉冲波形（方波、指数衰减波等），并支持设置脉冲宽度、次数、间隔、延迟等参数。

• 电穿孔室 / 电极结构 / 鳀（cuvette）或流动通道：用于安置细胞-载体混合液，电极可使电场作用于细胞。常见有比色皿型、平行板式、移液器式、微流控通道式等结构。

• 控制与监测系统：包括脉冲参数设置界面、高压输出监测、时间控制、安全保护（如短路检测、电弧保护）等。

• 辅助系统 / 连接装置：包括接地、导线、电缆、温控 / 冷却、细胞注入 / 回收、软件控制接口等。

现代电转染系统通常在仪器中预置多种细胞类型的优化参数，可直接调用，也支持用户手动设计新方案。

2. 仪器类型 / 分类

根据规模、通量、应用场景不同，电穿孔仪器可分为以下几类：

例如，Thermo Fisher 的 Neon NxT 电转染系统 就属于微量 / 移液器式系统，在很多难转染细胞（如免疫细胞、原代细胞、干细胞等）中具有高达 ~90% 的转染 / 基因编辑效率。thermofisher.cn+1

又如 MaxCyte 的系统则更偏重于大规模或细胞治疗级别的电穿孔厂线设备。MaxCyte

四、电穿孔实验流程与步骤

以下是一个较为规范的电穿孔实验操作流程，实际上针对不同细胞类型或仪器可能略有差异。

1. 细胞准备

• 细胞生长状态：选择处于对数期（活跃生长期）的细胞，状态良好，无污染，无过度融合。

• 清洗 / 离心：通常将细胞用平衡缓冲液（低导电 / 电穿孔缓冲）洗涤 1–2 次，去除培养基、血清、离子或其他干扰成分。

• 重悬 / 稀释：将细胞重悬于适合电穿孔的缓冲液中（低离子强度、适当渗透压条件）。细胞浓度一般为几十万至几百万/mL 级别，具体应按照仪器建议或优化条件调整。

• 加入外源物质：将待转染的 DNA、RNA、siRNA、蛋白、核酸–蛋白复合物等溶解在适配缓冲液中，然后与细胞悬液混合。注意混合均匀、避免气泡。

2. 装载入电穿孔腔室

• 将细胞–外源物混合液转移到电穿孔腔室或比色皿 / cuvette / 微流装置中。

• 对于移液器式系统，应按照吸头 / 腔室规格加载适量（例如 10 µL / 100 µL 等）。

• 确保液体覆盖电极、无气泡、位置正确，并正确连接仪器的高压输出与接地端。

3. 设置电穿孔参数并施加脉冲

在仪器控制界面上设定或调用预设方案，一般参数包括：

• 电压 / 电场强度（V 或 V/cm）

• 脉冲宽度 / 脉冲持续时间（microsecond ~ millisecond 范围）

• 脉冲个数 / 重复次数

• 脉冲间隔 / 延迟 /重复周期

• 波形类型（方波 / 指数衰减 / 多级 / 脉冲组合）

• 温度 / 冷却 / 脉冲循环控制

然后启动脉冲。脉冲作用期间，电场在腔室内建立，诱发膜孔隙形成，外源物质可能进入细胞。

4. 恢复 / 复苏 / 转染后处理

• 脉冲结束后，应尽快将细胞从腔室转移至适宜的培养条件（如预热的完全培养基、含有营养物质与抗坏死成分的培养液等）。

• 通常缓慢温和操作，避免剧烈震荡或温度骤变。

• 可在短暂室温或冰上静置数分钟以帮助膜修复。

• 然后将细胞置于适宜的培养条件（CO₂培养箱、适当温度、湿度等）继续培养。

• 24–72 小时后，评估转染效率（如荧光报告基因、RT-PCR、Western blot、流式细胞术等）。

5. 效果评估与优化

• 通过荧光显微镜、流式细胞术、qPCR、Western blot、功能性实验等评估转染效率、表达水平、细胞活力 / 存活率。

• 如效果不理想，则需要对参数进行优化调整（见下一节）。

五、电穿孔参数优化与关键因素

要在电穿孔实验中获得高转染效率与高细胞存活率，核心在于对各种参数的优化与控制。以下列出常见的影响因素与优化思路。

1. 关键参数与其影响

优化通常采用“单变量法”“正交试验法”“响应面法”等统计学方法降低实验量。

2. 典型优化策略与案例

• 在悬浮细胞（如免疫细胞、PBMC、T 细胞）中，通常电压较高、脉冲较短、多次脉冲组合更有利。

• 对于贴壁细胞（如某些上皮细胞、成纤维细胞等），可选择稍低电压或较长脉冲。

• 对于极难转染的原代细胞或干细胞，商业系统（如 Neon NxT、Nucleofector 等）通常提供预设优化方案。bioscience.lonza.com+2Thermo Fisher Scientific+2

• 有研究表明，将脉冲设计为“先低压预孔 + 高压推动”的组合型策略，可在某些细胞类型中提升效率与存活率。

• 在微流控 / 连续流系统中，通过设计较短通道、缩短细胞在电场区停留时间、降低热损害，可以实现高效率与高存活率的兼顾。SpringerLink+2科学直通车+2

例如，一篇报道介绍了一种流式电穿孔装置（flow-through electroporation device），将较大流道与小间距针电极阵列结合，既保持较高处理速度，又维持较好转染效率和存活率。Nature

另有文献报道多通道微流控电穿孔平台，可同时对 8 条通道进行操作，并优化波形与流速，以在 T 细胞转染中取得良好表现。SpringerLink

六、电穿孔的优点、局限与挑战

1. 优点

• 适用性广：可用于几乎所有细胞类型，包括细菌、酵母、植物细胞（消壁 / 原生质体）、哺乳动物细胞、干细胞、免疫细胞、难转染细胞等。thermofisher.cn+2生物设备+2

• 无载体 / 非病毒：避免病毒载体相关的安全性、包装限制、插入突变风险等问题。

• 快速、直接：操作简便、转染时间短，无需复杂的前处理或载体包装。

• 可控性强：通过调节脉冲参数、波形、缓冲条件等，可针对不同细胞设计优化方案。

• 可实现瞬时 / 稳定表达 / 基因编辑：对 DNA、RNA、siRNA、CRISPR-Cas9 复合物、蛋白质、核酸–蛋白复合物均可转染。thermofisher.cn+3Thermo Fisher Scientific+3Cell+3

• 高通量潜力：在微流控 / 连续流系统设计下，可以实现高通量和标准化。SpringerLink+2科学直通车+2

2. 局限与挑战

• 细胞损伤 / 低存活率：高强度电场可能使细胞膜无法完全修复，造成不可逆损伤或细胞死亡，是电穿孔最大的瓶颈。科学直通车+3thermofisher.cn+3生物设备+3

• 转染效率不稳定：参数稍有偏差，效率可能大幅波动。

• 热效应 / 析氧 / 电化学副反应：高电流可能导致溶液局部电热、气泡、pH 变化或副反应（如水分解、金属离子溶出等）损伤细胞。

• 体积 / 通量限制：传统比色皿 / 平行板结构受限于处理体积和电场均匀性。

• 操作复杂性 / 优化耗时：每种细胞类型、外源物性质、缓冲条件都可能需要重新优化。

• 定位 / 定向递送能力有限：传统批量电穿孔不能控制哪一个细胞接受转染，缺乏精细定位能力。

因此，实践中很多研究者倾向将电穿孔与其他辅助技术（如纳米材料辅助、局部电场聚焦、微流控电极阵列等）结合，以弥补其缺点。

七、应用领域与实例

电穿孔仪在基础研究、应用研究及产业化中有广泛应用。以下列出若干典型案例与应用方向。

1. 基础研究

• 基因功能研究：通过将过表达质粒、siRNA/shRNA、CRISPR-Cas9 构建导入细胞，研究基因敲除、敲入、敲低、报告基因表达等。

• 细胞信号通路与分子机制探索：将标记蛋白、荧光探针、标签融合蛋白导入细胞，实时监测细胞内信号、定位、作用机制等。

• 蛋白 / 核酸–蛋白质复合物递送：直接转染蛋白、核蛋白复合物 (RNP)，减少转录 / 翻译中间环节，更快实现功能。

• 单细胞 / 定位转染研究：结合微电极或纳米结构进行单细胞电穿孔，用于精细控制与定位导入。

2. 细胞治疗 / 临床前研究

• CAR-T / CAR-NK 等免疫细胞工程：将 CAR 构建体、CRISPR-Cas9 组件、电转导入 T / NK 细胞，生成具有特定功能的免疫细胞。电穿孔是非病毒基因导入的一种可选方案。

• 干细胞 / 诱导多能干细胞 (iPSC) 操作：对干细胞 / iPSC 进行基因编辑、报告基因导入等操作。

• 基因治疗载体构建 / 递送研究：在临床前阶段，将治疗性基因载体或编辑组件导入目标细胞模型中验证效果。

• RNA 疫苗 / 体外 mRNA 转染：将 mRNA、siRNA、miRNA 转染至细胞，用于疫苗研究、基因调控等。

• 药效筛选 / 药物递送评估：在体外模型中，将药物、探针、编辑组件导入细胞进行功能验证。

近年来有论文回顾电穿孔 / 电转染用于细胞治疗及核酸 / 蛋白转导的趋势与挑战。Cell

3. 工业 / 产学研场景

• 高通量转染 / 筛选平台：将电穿孔仪与自动化平台、液体处理机器人结合，实现规模化、自动化转染筛选。

• 合成生物学 / 代谢工程：在微生物 / 植物 /酵母中使用电穿孔进行载体导入、代谢途径重构等。

• 农业 / 植物研究：在植物原生质体或去壁细胞中使用电穿孔进行基因转化实验。

• 生物制剂 / 生物制药：在细胞系构建、工程细胞生产等环节，可使用电穿孔将构建体导入细胞。

举例：Bio-Rad 推出的 Gene Pulser Xcell 电穿孔系统就可用于不同细胞类型（包括原代细胞、菌类、真菌、T 细胞等）的转染实验。Bio-Rad

在细胞治疗领域，MaxCyte 的电穿孔平台被设计用于规模化、可重复、安全的细胞转染操作。MaxCyte

八、未来发展趋势与前沿技术

随着微纳米技术、微流控技术、材料科学、自动化控制和合成生物学的发展，电穿孔仪器和技术也在不断演进。以下是几个值得关注的趋势与方向：

1. 微流控 / 连续流 / 并行电穿孔系统

传统批量电穿孔设备在大体积、均匀性、热损伤、参数控制等方面存在瓶颈。微流控 / 连续流设计可以在流动状态下对细胞进行电穿孔，具有以下优势：

• 减少单个细胞在电场区的停留时间，降低热损伤；

• 实现高通量、并行处理；

• 控制更精细的电极结构和电场分布；

• 易于集成自动化与在线监测。

已有多篇文献报道多通道微流控电穿孔平台、芯片型局部电穿孔装置、流通式电穿孔器件等。Nature+3SpringerLink+3科学直通车+3

2. 局部 / 微区 / 定向电穿孔

通过在细胞或组织表面设计微电极、纳米针、纳米孔阵列等，可实现对单个细胞、细胞器或亚细胞区域的精准转染。例如微陷阱 (microtrap) 电穿孔阵列，可将单个细胞捕获在电极附近并定向施加电场，从而实现高精度导入。科学直通车

这种方法有望用于神经元、体外组织模型、三维细胞团 (organoid) 或组织切片微注入。

3. 自动化、可编程与人工智能优化

未来电穿孔仪可能更具智能化：

• 自动化参数优化：结合机器学习 / AI 算法根据反馈优化电压 / 脉冲参数。

• 实时监测与反馈控制：在线监测膜电阻、细胞电流变化、温度、电化学信号等，实时调整脉冲条件。

• 用户友好界面与“一键转染”方案：对于常用细胞类型提供标准化预设程序。

• 与自动化液体处理系统 / 机器人整合，实现大规模转染筛选平台。

4. 新材料 / 纳米结构辅助电穿孔

结合纳米材料（如纳米金属线、碳纳米管、石墨烯、纳米棒 / 梯状电极结构等）或表面修饰技术，增强电场局部强度、减小损伤、辅助孔隙稳定化，从而改善转染效率和细胞活力。

5. 电穿孔 + 辅助技术耦合

将电穿孔与其他转染辅助方法结合（例如电穿孔 + 脂质体辅助、纳米载体 + 电场辅助、超声 + 电场、磁场辅助导入等），以发挥协同作用、提升效率与稳定性。

6. 细胞治疗 / 临床级电穿孔仪器标准化

在细胞治疗（如 CAR-T、基因编辑治疗细胞）领域，对设备的安全性、可重复性、无菌性、可扩展性等要求极高。未来电穿孔仪将在 GMP 兼容设计、标准操作流程 (SOP)、质量控制和法规符合性方面不断提升。MaxCyte 等公司正沿此方向发展。MaxCyte

九、总结与建议

电穿孔仪（细胞转染方向）作为一种经典而灵活的物理转染手段，具备适用性广、无载体、安全、可调参数、操作简单等优点。在许多“难以转染”的细胞类型（如原代细胞、干细胞、免疫细胞等）中，电穿孔常是首选或备选方法。

然而，其主要瓶颈在于细胞损伤和转染效率 / 存活率之间的平衡。因此，在具体实验中必须进行精细的参数优化和操作控制。此外，随着微流控、自动化、纳米结构与智能控制等技术的发展，电穿孔仪在高通量、精准、可重复性方面正不断进步，并有望在细胞治疗、基因编辑、合成生物学等应用中发挥更大作用。