发布时间： 2026-01-07 · 新闻信息
二氧化碳培养箱（CO₂培养箱）是哺乳动物细胞培养的核心设备之一。它通过稳定控制温度、二氧化碳浓度与湿度，为细胞提供接近体内的生长环境。细胞实验能否稳定、可重复，往往不取决于“操作动作是否熟练”，而取决于培养箱环境是否长期稳定、培养基是否正确预处理、日常操作是否减少波动以及污染是否得到有效控制。下面按从准备到日常实验的顺序，系统说明如何依托CO₂培养箱开展细胞实验。
温度控制
多数哺乳动物细胞在37℃下生长最佳。温度偏高会造成细胞应激、凋亡增加；偏低会使代谢变慢、生长速度下降，甚至改变基因表达背景。培养箱需要具备良好的温度稳定性与均一性，实验过程中也应尽量减少开门次数，以降低温度波动。
二氧化碳控制与pH稳定
常用培养基一般采用碳酸氢盐缓冲体系，其pH稳定依赖培养箱内CO₂浓度。CO₂偏低时培养基偏碱，颜色会更偏紫红；CO₂偏高时培养基偏酸，颜色会更偏黄。pH波动会直接影响细胞增殖和形态，甚至导致实验结果漂移。因此CO₂浓度准确性与长期稳定性非常关键。
湿度控制与防蒸发
培养箱内通常通过水盘维持高湿度（接近95%），以减少培养基蒸发。湿度不足会导致培养基浓缩、渗透压升高，从而引发细胞应激和死亡，尤其对长时间培养或小体积培养更敏感。水盘水量、清洁度和更换频率是培养箱维护的重要内容。
培养箱启动与稳定
首次启用、移动后重新安置或完成深度清洁后，应设置温度37℃、CO₂ 5%（按细胞系或培养基要求调整）并加满水盘，空载运行至少6至12小时，确保温度、CO₂和湿度稳定后再放入细胞。
参数校准与监测
培养箱显示值并不等于实际值。建议定期校准：
温度校准：用经校准的温度计或探头放置在培养箱中进行比对。
CO₂校准：用独立CO₂分析仪或经校准的外置探头测量培养箱实际浓度并校正。
校准频率建议至少每月一次或按实验室管理制度执行。出现Ct值异常漂移、培养基颜色长期异常等情况时，应优先检查CO₂与温度是否偏离。
箱内摆放与分区原则
不要过度堆放，保证气流循环。
常用细胞置于中层，减少开门造成的温度与CO₂波动影响。
不同来源细胞系尽量分区摆放，避免交叉污染。
禁止将外包装纸箱、非无菌物品或易掉屑材料放入箱内，降低污染风险。
很多细胞实验失败来源于一个常被忽略的步骤：培养基预平衡。预平衡是指将培养基提前放入37℃、5%CO₂培养箱中，使其温度、CO₂溶解与pH达到稳定状态。
为什么要预平衡
冷培养基直接加入细胞会产生温度冲击，导致应激。
培养基在空气中暴露会导致CO₂逸散，pH偏碱。
pH短时间波动可能改变细胞代谢与表达背景，影响实验一致性。
如何预平衡
计划使用的培养基提前放入培养箱至少30至60分钟。
PBS、胰酶等也应预温至接近37℃后再使用。
大瓶培养基可先在37℃水浴预温，再放入培养箱进行CO₂平衡。
日常细胞实验通常包括复苏、换液、传代、实验处理以及收样。培养箱环境稳定与操作节奏控制贯穿整个过程。
基本步骤：
1）从液氮取出冻存管，快速在37℃水浴中融化，时间尽量短（通常1至2分钟）。
2）用75%酒精擦拭冻存管外壁后放入超净台。
3）将细胞缓慢加入预温培养基中稀释DMSO。
4）根据细胞敏感性决定是否离心去除冻存液。
5）重悬后接种至培养瓶或培养板。
6）放入CO₂培养箱。
7）12至24小时后观察贴壁情况并根据需要更换新鲜培养基以去除死亡细胞。
复苏后的24至72小时细胞最脆弱，培养箱参数稳定和换液节奏合理非常重要。
换液频率依细胞生长速度而定，常见为1至2天一次。换液要点：
培养基必须预温与预平衡。
操作尽量快，减少细胞在室温暴露时间。
换液后轻轻摇晃使细胞均匀分布，再放回培养箱。
记录换液时间，避免过久不换导致培养基酸化。
通过观察培养基颜色也可粗略判断是否需要换液：颜色明显变黄通常提示酸化或细胞密度较高，应及时补充新鲜培养基并排查污染可能。
常见胰酶消化法流程：
1）观察细胞融合度，一般达到80%至90%较适合传代。
2）吸去旧培养基，用预温PBS轻洗一次。
3）加入适量胰酶消化液，短时间消化并随时显微镜观察。
4）当细胞边缘变圆、开始脱落时，及时加入含血清培养基终止消化。
5）吹打成单细胞悬液。
6）按比例分瓶或分板（常见1:3、1:5、1:10，视细胞系而定）。
7）放入培养箱培养，并标注日期与传代次数。
传代常见问题包括消化过度导致细胞死亡或贴壁差、消化不足导致成团影响生长、接种密度不合适导致生长慢或过快。传代操作时避免培养箱门长时间打开，减少温度和CO₂波动造成的应激。
处理类实验的通用原则：
药物、转染试剂、缓冲液和培养基提前预温。
尽量一次性完成多个孔板操作，减少培养箱反复开门。
需要严格时间控制的处理（例如6小时或12小时）必须规范记录与计时。
若需要无血清或低血清条件，提前设计对照组并评估细胞耐受性。
污染是细胞培养中最常见且破坏性最大的风险，主要包括细菌、真菌和支原体污染。
日常防污染习惯
所有进箱物品必须无菌。
操作前后用酒精清洁手套与工作台面。
不将纸盒、标签纸屑、外包装等放入培养箱。
定期更换水盘水，保持水盘清洁。
新引入细胞系应进行支原体检测与隔离培养。
培养箱清洁与消毒
不同型号培养箱可能配有高温灭菌、紫外消毒或HEPA过滤系统，具体按说明书与实验室制度执行。通用建议包括：
定期擦拭内壁与搁板。
水盘每周清洗消毒并换水。
每月或每季度进行一次深度清洁。
若发生污染，应及时移出所有培养物，进行彻底清洁与消毒，并更换过滤组件或按规范处理。
培养基变黄（偏酸）
可能原因：细胞密度过高、换液不及时、CO₂偏高、污染。建议立即观察是否浑浊、显微镜下是否有异物，并检查CO₂校准。
培养基偏紫红（偏碱）
可能原因：CO₂偏低、培养基暴露空气时间过久、培养箱门频繁开关导致CO₂波动。应检查CO₂浓度并减少开门时间，培养基使用前进行预平衡。
细胞生长慢、状态差但无明显污染
高度怀疑支原体污染或培养条件长期轻微偏差。建议做支原体检测，同时核对培养箱温度与CO₂是否准确，检查培养基批次与血清质量。
二氧化碳培养箱是一个需要持续维护的环境系统。只要做到以下要点，细胞状态和实验重复性通常会明显改善：
1）培养箱温度、CO₂和湿度长期稳定，且定期校准。
2）培养基、PBS与胰酶等使用前预温并进行CO₂平衡。
3）减少开门次数与开门时间，避免环境波动。
4）严格执行无菌操作，定期清洁培养箱与水盘。
5）建立污染预警机制，尤其重视支原体检测。
6）传代控制好消化时间和接种密度，形成可复制的SOP。
只要把这些基础环节做扎实，细胞培养会从“经常翻车”变成“可控稳定”，后续的转染、药物处理、免疫染色、qPCR、WB等实验也会更可靠。
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